Эндогенный гиперкортицизм, и в частности болезнь Иценко-Кушинга (БИК), представляет собой тяжелое хроническое эндокринное заболевание, основой патогенеза которого является гиперпродукция надпочечниками кортизола, что приводит к усилению катаболических процессов практически во всех тканях организма и, как следствие, полиорганным нарушениям [1]. Одним из них является глюкокортикоид-индуцированный остеопороз (ГКО), который характеризуется снижением костеобразования под действием гиперкортизолемии и приводит в  конечном итоге к низкотравматическим переломам [2, 3].

В связи с тем, что болезнь Иценко-Кушинга развивается у пациентов достаточно молодого, т.е. трудоспособного, возраста [4, 5], ГКО (даже без учета других осложнений гиперкортицизма) представляется весьма значимой проблемой не только медицинского, но и социально-экономического характера. Его диагностика с помощью стандартной методики – рентгеновской остеоденситометрии – нередко затруднена: низкотравматические переломы при ГКО могут происходить при значениях минеральной плотности кости, соответствующих остеопении и даже возрастной норме [6-8], что указывает на недостаточную чувствительность метода при данной патологии. Необходим вспомогательный маркер, специфичный для костной ткани, который бы позволял заподозрить наличие ГКО и в целом болезни Иценко-Кушинга. Ранее таким маркером был назван остеокальцин [9], однако он относится к неколлагеновым белкам костного матрикса и поэтому лишь отчасти может отражать деструкцию костной структуры, особенно трабекулярной. В качестве альтернативы нами решено было рассмотреть маркер коллагеновой природы – P1NP.

N-концевой пропептид проколлагена 1 типа (procollagen type 1 N-terminal propeptide, P1NP) является специфическим продуктом остеобластов и в меньшей степени – фибробластов, протеолитически отщепляясь от молекулы проколлагена 1 типа. Его сывороточный уровень, таким образом, прямо коррелирует с концентрацией коллагена 1 типа в костной ткани. Высвобождаясь в кровоток в виде трехмерной структуры (интактный P1NP), он уже при температуре 37°C распадается с образованием низкомолекулярной (мономерной) формы, стабильной как in vivo [10], так и in vitro при комнатной температуре [11]. Преимущественно мономерная форма обнаруживается в сыворотке крови пациентов с терминальной почечной недостаточностью (ХБП С5Д) и ограничением подвижности (пожилые лежачие больные) [12]. Это объясняется особенностями клиренса этого соединения: интактная форма метаболизируется в основном печенью, в то время как мономерная выводится почками, что затрудняет определение истинных значений маркера при использовании диагностических наборов, измеряющих уровень общего P1NP (включающего обе формы) [13]. В проведенных ранее исследованиях P1NP продемонстрировал низкую индивидуальную вариабельность [14] и отсутствие ярко выраженного циркадианного характера выделения в кровь [15]. Он успел зарекомендовать себя при постменопаузальном остеопорозе в качестве чувствительного маркера эффективности лечения при назначении анаболической терапии: его содержание в крови увеличивалось в течение первых 3 месяцев на 40-80% и более [15, 16]. Благодаря этому P1NP был рекомендован для использования в клинических исследованиях при мониторинге эффективности лечения остеопороза Международным фондом по изучению остеопороза (IOF) и Международной федерацией клинической химии и лабораторной медицины (IFCC) [14].

Изучить диагностические возможности P1NP в качестве дополнительного маркера эндогенного гиперкортицизма (болезни Иценко-Кушинга) по сравнению с остеокальцином.

Дизайн исследования

Исследование проведено как одноцентровое одномоментное по типу «случай-контроль», со сплошной выборкой пациентов (при условии соответствия критериям включения).

Критерии соответствия

Критерии включения: установленный согласно действующим клиническим рекомендациям [17] диагноз БИК в активной стадии заболевания (до нейрохирургического лечения). Здоровые добровольцы для формирования группы контроля подбирались по полу, возрасту и индексу массы тела (ИМТ).

Критериями исключения являлись: ремиссия заболевания; прием глюкокортикоидов (в т.ч. вследствие надпочечниковой недостаточности в исходе хирургического лечения), медикаментов, оказывающих значимое модифицирующее влияние на минеральный и костный обмен (препараты тестостерона, менопаузальная гормональная терапия, комбинированные оральные контрацептивы, экзогенный гормон роста), и препаратов для лечения остеопороза на момент включения в исследование; первичный и вторичный гипогонадизм, в т.ч. требующий приема половых стероидов; гипопитуитаризм; тяжелые, жизнеугрожающие состояния (острая почечная и печеночная недостаточность, инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения и пр.) и терминальные состояния; острые инфекции; обострение хронических заболеваний; тяжелые психиатрические заболевания; длительная (>1 недели) общая иммобилизация; беременность; злоупотребление алкоголем; другие заболевания, приводящие к вторичному остеопорозу (помимо эндогенного гиперкортицизма).

Условия проведения

Исследование проведено на базе отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» МЗ РФ (г. Москва). Включались пациенты с клинически и лабораторно подтвержденным диагнозом болезни Иценко-Кушинга, находившиеся на обследовании в указанном отделении, а также здоровые лица, вошедшие в контрольную группу. Каких-либо специфических факторов, способных повлиять на внешнюю обобщаемость выводов исследования и возможность их экстраполяции, не выявлено. Все участники – как пациенты, так и здоровые лица – подписали информированное согласие.

Продолжительность исследования

Набор материала продолжался с осени 2015 г. по осень 2016 г. Изучаемые маркеры костеобразования исследовались в сыворотке крови одномоментно после завершения сбора биологических образцов.

Описание медицинского вмешательства

У всех участников исследования однократно производился забор крови натощак с последующим центрифугированием при температуре -5°C в течение 30 мин (с частотой 3000 об./мин) и замораживанием взятых образцов в аликвотах при температуре ниже -20°C. Предварительно участники заполняли опросники для выяснения их соответствия критериям включения/исключения (см. Критерии соответствия).

Основной исход исследования

Точки вмешательства (отрезные точки) для маркеров костеобразования – остеокальцина и P1NP, – а также их чувствительность и специфичность были рассмотрены в качестве суррогатных конечных точек нашего исследования. Данные показатели позволяют оценить применимость P1NP в качестве дополнительного диагностического маркера при болезни Иценко-Кушинга.

Дополнительные исходы исследования

Показатели гормональной активности аденомы гипофиза у пациентов с БИК: значения кортизола и АКТГ в утреннее (8:00) и вечернее (23:00) время, свободного кортизола в суточной моче и кортизола в вечерней (23:00) слюне.

Методы регистрации исходов

Для исследования маркеров костеобразования применялся электрохемилюминесцентный метод: Cobas 6000 Module e601 (Roche, Швейцария) – для остеокальцина (референсный интервал 11-43 нг/мл) и Cobas e411 (Roche, Швейцария) – для P1NP. Референсные значения последнего зависят от возраста и пола пациента [18]:

моложе 1 года: 830-1850 нг/мл;

1-2,9 года: 400-1500 нг/мл;

3-11,9 лет: 300-900 нг/мл;

12-16,9 лет: 220-1600 нг/мл;

17-17,9 лет: 80-480 нг/мл;

18-20,9 лет: 60-220 нг/мл;

21-24,9 лет: 35-140 нг/мл;

25 лет и старше: 20-85 нг/мл.

моложе 1 года: 900-1800 нг/мл;

1-2,9 года: 500-1500 нг/мл;

3-9,9 лет: 300-1000 нг/мл;

10-13,9 лет: 140-1200 нг/мл;

14-17,9 лет: 40-460 нг/мл;

18-24,9 лет: 20-110 нг/мл;

25-34,9 лет: 20-85 нг/мл;

35 лет и старше (пременопауза): 15-60 нг/мл;

35 лет и старше (постменопауза): 20-115 нг/мл.

Диагноз болезни Иценко-Кушинга устанавливался или исключался, исходя из действующих клинических рекомендаций [17], с определением суточного ритма кортизола и АКТГ, проведением анализа свободного кортизола в суточной моче и кортизола в вечерней слюне, МРТ головного мозга, а также, при необходимости дифференциальной диагностики причин АКТГ-зависимого гиперкортицизма –селективного забора венозной крови из нижних каменистых синусов. АКТГ в плазме и кортизол в сыворотке крови оценивались с помощью электрохемилюминесцентного метода (Cobas 6000 Module e601 (Roche, Швейцария)). Референсные значения составили: для кортизола 46-270 нмоль/л в вечерние часы; для АКТГ – 7-66 пг/мл утром и 0-30 пг/мл соответственно. Для определения уровня свободного кортизола в слюне использован электрохемилюминесцентный модуль Cobas e601 (Roche, Швейцария) (0,5−9,4 нмоль/л). Свободный кортизол в суточной моче измерен иммунохемилюминесцентным методом (анализатор Vitros ECi (США, Великобритания) (референсные значения 60−413 нмоль/сут)).

Этическая экспертиза

Локальным Этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, согласно протоколу №12 Заседания Комитета от 28.10.2015 г., постановлено, что планируемая научная работа соответствует этическим стандартам добросовестной клинической практики и  может быть проведена на базе отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «НМИЦЭ» МЗ РФ.

Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: Ввиду отсутствия пилотных исследований, а также в силу редкой встречаемости болезни Иценко-Кушинга в популяции размер выборки был установлен эмпирически.

Методы статистического анализа данных: Анализ данных производился в пакете статистических программ IBM SPSS Statistics Base (SPSS, США). Нормальность распределения устанавливалась тестом Колмогорова-Смирнова. Количественные значения признаков представлены как медианы (median, Me) и 25-й и 75-й процентили (Q25%;Q75%). Для оценки различий по количественным параметрам был использован непараметрический вариант однофакторного дисперсионного анализа – критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился также непараметрическим методом – применялся расчет коэффициента корреляции Спирмена (ρ). С целью определения отрезной точки (cut-off point) диагностики БИК с использованием P1NP в качестве дополнительного маркера был осуществлен ROC-анализ (построение кривой операционной характеристики) с определением чувствительности и специфичности метода. В качестве оптимальной отрезной точки был принят уровень показателя, которому соответствовало максимальное значение суммы чувствительности (пропорция истинно положительных результатов, подтвержденных тестируемым методом, по отношению к золотому стандарту) и специфичности метода (пропорция истинно отрицательных результатов, подтвержденных тестируемым методом, по отношению к золотому стандарту), полученных в ходе ROC-анализа [19]. Прогностическая ценность положительного результата (количество истинно положительных результатов диагностического теста / (количество истинно положительных результатов диагностического теста + количество ложноположительных результатов диагностического теста)); прогностическая ценность отрицательного результата (количество истинно отрицательных результатов диагностического теста / (количество истинно отрицательных результатов диагностического теста + количество ложноотрицательных результатов диагностического теста)); отношение правдоподобия для положительного результата теста (чувствительность / (1 – специфичность)) – были рассчитаны согласно указаниям, приведенным в специализированных изданиях [20] и тематических публикациях [21]. Площади под кривыми операционных характеристик (AUC) были измерены для демонстрации возможностей диагностических тестов верно оценивать истинно положительные и истинно отрицательные результаты и для сравнения качества этих тестов [22, 23]. Расчет доверительных интервалов (ДИ) чувствительности и специфичности произведен с помощью онлайн-калькулятора Confidence Interval Calculator (https://www.pedro.org.au/wp-content/uploads/CIcalculator/, последнее обновление 24.03.2011 г.), основанного на методе Уилсона [24].

Объекты (участники) исследования

Было обследовано 29 пациентов с болезнью Иценко-Кушинга и 27 условно здоровых лиц, из них 22 мужчины и 34 женщины. Общая характеристика участников исследования приведена в Таблице 1. За основной диагностический признак эндогенного гиперкортицизма принят уровень кортизола в вечерней слюне (как достаточно точный показатель избыточной продукции кортизола, имеющий преимущество в виде более простой методики получения диагностического материала и большей комплаэнтности обследуемых при выполнении требований к правильности его сбора и при этом не уступающий по чувствительности определению суточной экскреции кортизола [25]).

Таблица 1. Краткая характеристика включенных в исследование лиц (приводится медиана и 25-75 процентили)

Таблица 2. Диагностические индексы для исследования остеокальцина и P1NP в сыворотке крови в целях выявления эндогенного гиперкортицизма (БИК)

Основные результаты исследования

Площадь под кривой операционной характеристики (AUC) была существенно меньше для P1NP – 0,808 (95% ДИ 0,693–0,924) – в сравнении с остеокальцином – 0,925 (95% ДИ 0,857–0,992) (см. Рисунок 1), что свидетельствует о большей диагностической ценности остеокальцина для верификации БИК среди здорового контроля. Однако при таком значении площади под кривой операционной характеристике P1NP также имеет значение для диагностики.

Рисунок 1. ROC-анализ для отрезных точек P1NP и остеокальцина при эндогенном гиперкортицизме (БИК)

На основании ROC-анализа были получены различные точки вмешательства, из которых выбраны оптимальные (максимальная сумма чувствительности и специфичности) (см. Таблицу 2). Значения ниже отрезных точек (cut-off point) для обоих маркеров свойственны пациентам с БИК. Исходя из приведенных в таблице результатов, можно заключить, что, P1NP также может рассматриваться как потенциальный диагностический маркер при БИК.

Дополнительные результаты исследования

Результаты исследования свободного кортизола в суточной моче, как и данные анализа кортизола в вечерней слюне, подтвердили наличие эндогенного гиперкортицизма: медиана составила 1332,00 нмоль/сут (584,80;3850,00). Показатели АКТГ утром и вечером – 84,6 пг/мл (64,22;104,98) и 67,09 пг/мл (51,37;82,82) соответственно. Таким образом, уровни гормонов существенно превышают референсные значения для использованных диагностических наборов. У всех пациентов было подтверждено наличие аденомы гипофиза, ввиду чего диагноз болезни Иценко-Кушинга у включенных в эту группу не вызывает сомнений.

При корреляционном анализе выявлена отрицательная связь между уровнем кортизола в вечерней слюне и P1NP (ρ = -0,651, p <0,001), а также сильная положительная связь между остеокальцином и P1NP (ρ = 0,915, p <0,001).

Нежелательные явления

Нежелательных явлений в ходе исследования отмечено не было.

Резюме основного результата исследования

Было установлено подавление маркеров костеобразования – остеокальцина и N-концевого пропептида проколлагена 1 типа (P1NP) у пациентов с болезнью Иценко-Кушинга. В результате ROC-анализа возможность использования P1NP в диагностике БИК подтверждена, однако, несмотря на хорошую чувствительность маркера, по специфичности он значительно уступает остеокальцину, ранее уже зарекомендовавшему себя в качестве дополнительного диагностического теста при этом заболевании. Тем не менее, P1NP может быть полезен для применения у пациентов с БИК и эндогенным гиперкортицизмом ввиду своего происхождения, благодаря которому он способен давать представление об интенсивности процессов синтеза и деградации коллагенового матрикса.

Обсуждение основного результата исследования

У пациентов с болезнью Иценко-Кушинга, в отличие от лиц из группы контроля, маркеры костеобразования были подавлены: как ранее описанный остеокальцин [26, 27], так и маркер костеобразования коллагеновой природы – P1NP. Последний также может рассматриваться как потенциальный диагностический биомаркер эндогенного гиперкортицизма, но его диагностические возможности уступают таковым остеокальцина при прямом сравнении по площади под кривой операционной характеристики. При этом известно, что остеокальцин в декарбоксилированной форме у грызунов и потенциально – у человека обладает гормональной активностью, участвуя в регуляции углеводного обмена, увеличивая секрецию инсулина и улучшая выживаемость β-клеток поджелудочной железы [28, 29]. Может ли это обстоятельство влиять на уровень остеокальцина в сыворотке крови, а также обусловливать бóльшую чувствительность этого маркера при БИК по сравнению с P1NP, остается предметом для дальнейшего изучения.

Как и ранее с остеокальцином [26], обнаружена отрицательная корреляция между P1NP и кортизолом в  вечерней слюне. Это в очередной раз подтверждает подавление костеобразования при эндогенном гиперкортицизме, в частности при БИК. При этом очень сильна взаимосвязь остеокальцина и P1NP. Следовательно, в качестве маркера костеобразования P1NP может использоваться в клинической практике у пациентов с  БИК наравне с остеокальцином. Несмотря на меньшую специфичность определения P1NP в целях диагностики БИК, этот биомаркер является белком коллагеновой природы и непосредственным индикатором формирования коллагена 1 типа, составляющего основу органического матрикса костной ткани, а стало быть, способен точнее отражать процессы, происходящие в трабекулярном компартменте кости в условиях эндогенного гиперкортицизма. Кроме того, он не обладает, по имеющимся на сегодняшний день данным, гормональной активностью, что в определенных случаях также может давать ему преимущество перед остеокальцином.

Клинические ситуации, при которых измерение P1NP нерационально ввиду ложно завышенных значений – терминальная почечная недостаточность (ХБП С5Д) [13] и метастатическое поражение костей [30], – были исключены в нашем исследовании еще на этапе формирования групп, поэтому сомнений в достоверности полученных результатов нет.

Ограничения исследования

На полученные в нашем исследовании результаты мог оказать влияние малый объем произведенной выборки (каждая из рассмотренных групп включала в себя не более 30 человек). Однако подобное исследование (оценка диагностических возможностей P1NP для выявления БИК в популяции) проводится впервые, поэтому эмпирическое определение количества участников в группах могло иметь место. Кроме того, редкость данного заболевания оказывала влияние на формирование выборки (осуществление сплошного набора участников по принципу соответствия критериям включения).

Подавление уровня маркеров костеобразования – остеокальцина и P1NP – при болезни Иценко-Кушинга отражает угнетение синтеза костного матрикса вследствие гиперкортицизма. У лабораторных животных (в частности, у мышей) уже было доказано наличие гормональной активности декарбоксилированной формы остеокальцина, в то время как эндо- или паракринные эффекты P1NP установлены не были. Вовлеченность остеокальцина в метаболические процессы у человека, степень взаимосвязи нарушений углеводного обмена, часто развивающихся у пациентов с болезнью Иценко-Кушинга, с бóльшей диагностической («разрешающей») способностью измерения остеокальцина по сравнению с P1NP в этой когорте больных недостаточно изучена и требует уточнений. Проведенное нами исследование позволяет сделать вывод о преимуществе остеокальцина над P1NP при их использовании в качестве диагностических тестов с целью выявления болезни Иценко-Кушинга в популяции, несмотря на сильную корреляцию между этими маркерами и значимую отрицательную связь между активностью заболевания и уровнем P1NP. Могут ли нарушение метаболизма глюкозы, гиперинсулинемия и инсулинорезистентность влиять на уровень остеокальцина в сыворотке крови, а также обусловливать бóльшую чувствительность этого маркера при БИК по сравнению с P1NP, на сегодняшний день неизвестно. Использование остеокальцина в качестве дополнительного диагностического критерия в случаях подозрения на вторичный характер остеопороза, особенно у молодых пациентов, в целом представляется оправданным. Что касается P1NP, то, учитывая тесную связь сывороточной концентрации этого показателя с интенсивностью синтеза коллагена 1 типа, может иметь смысл его применение в целях диагностики и контроля эффективности лечения глюкокортикоид-индуцированного остеопороза, что, однако, требует дальнейших исследований на эту тему.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Гранта Президента РФ для молодых ученых МД-3204.2017.7.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Т.Т. Цориев – планирование исследования, обзор литературы по теме исследования, набор участников групп (пациенты и контроль) согласно критериям соответствия, сбор клинического материала (физикальные, лабораторные данные), проведение статистического анализа полученных данных, написание текста статьи; Ж.Е. Белая – планирование исследования, руководство проведением исследования, проведение статистического анализа полученных данных, редактирование текста статьи; Л.Я. Рожинская – научное консультирование в ходе написания статьи в качестве эксперта; Л.В. Никанкина – проведение анализа лабораторных показателей (остеокальцина и P1NP) в предоставленных образцах сыворотки крови. Авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.