Введение К настоящему времени сахарный диабет (СД) приобрёл угрожающие масштабы: по данным государственного регистра на январь 2011 года число больных в России составляет более 3,3 млн. человек, 9,1% из которых страдают СД 1-го типа, однако есть опасения, что действительная распространённость СД в 3 раза выше [1]. Высокая смертность и ранняя инвалидизация больных в связи с развитием осложнений делают очевидной высокую социальную значимость заболевания [2]. К числу хронических осложнений СД относят различные формы диабетической остеопатии [3]. Говоря о развитии патологических изменений в костной ткани у больных СД, нельзя не отметить, что многие аспекты данной проблемы остаются неясными: частота поражений костно-суставного аппарата колеблется в весьма широких пределах [4], не до конца ясными остаются патогенетические механизмы развития остеопатических процессов [5]. Так, в рандомизированном контролируемом одномоментном исследовании, проведённым Шепелькевич А. П., установлено снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ) в области шейки бедра у 20% обследованных пациентов с СД 1-го типа [6]. В другом одномоментном исследовании, проанализированном в обзоре Hofbauer et al, остеопения в той же области выявлена у 44% больных с инсулинзависимым СД [5]. В ряде экспериментальных работ с грызунами также наблюдались изменения в минеральном составе костной ткани. В опыте с аллоксан-индуцированными крысами линии Спрег-Доули в бедренной кости общее содержание минеральных компонентов (взвешивание золы после выгорания органических компонентов кости) и количество кальция (измерения колориметрическим методом) к исходу пятой недели эксперимента снизилось соответственно на 14,82% и 16,27% по сравнению с контролем [7]. В опытах с аллок-сан-индуцированным сахарным диабетом у крыс на 30 день наблюдения зафиксировано снижение количества кальция (измерения титрометрическим методом по де Ваарду) в бедренной кости на 21,4% по сравнению с контролем [8]. Минеральная фаза компактной костной ткани представлена, в основном, фосфорно-кальциевыми неорганическими солями, содержание которых составляет 45-49% от массы кортикальной кости и придаёт ей механическую жёсткость и прочность [9, 10]. Потеря минеральных составляющих кости приводит к остеопении и снижению её прочностных характеристик, что подтверждено в работах с экспериментальным диабетом на крысах [7, 8, 11]. Однако планомерные исследования на предмет изменения содержания минеральных составляющих в костной ткани на разных этапах диабета отсутствуют. В связи с этим целью данной работы является исследование изменений содержания кальция и фосфора в компактной костной ткани в динамике экспериментального СД. материалы и методы Эксперимент проведён на 70 белых беспородных кры-сах-самцах массой 180-220 г. с соблюдением принципов гуманного обращения с животными, изложенных в Хельсинской декларации (2000). Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к корму и воде. Получена одобрительная форма локального этического комитета № 371 от 23 июня 2013 года. Исследовали 2 группы животных. Контрольную группу составили 10 интактных крыс, которым однократно вводили 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Опытную группу составили 60 крыс с аллоксановым диабетом. Аллоксановый диабет индуцировали путём однократного подкожного введения аллоксана тетрагидрата («Sigma-Aldrich», США) в дозе 170 мг/кг веса животного по методу Н.А. Пальчиковой [12]. Летальность в ходе эксперимента составила 40%. Воспроизведение диабета контролирова- ли по совокупности показателей: уровня глюкозы в плазме крови глюкозооксидазным методом («Ольвекс Диагности-кум», Россия) и уровня гликозилированного гемоглобина в цельной крови (тест-система «Nycocard-HbA1c» на рефлектометре «Nycocard Reader II», Великобритания). Животных выводили из эксперимента под кратковременным эфирным наркозом на 7, 14, 21, 28 дни опыта. Количество кальция (ca) и фосфора (P) определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивносвязанной плазмой на спектрометре «Spectro flame modulas» [Методические указания]. Погрешность в измерениях составляет ±0,1 мг. Объектами анализа являлись гидролизаты навесок диафиза бедренной кости массой 5 мг. В гомогенатах бедренной кости определяли активность щелочной фосфатазы унифицированным методом по «конечной точке» (ЩФ, «ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА-ВИ-ТАЛ-02», «Витал Диагностик», Россия). Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.1 фирмы Stat Soft. В группах выборки определяли медиану (Ме) и межквартиль-ный интервал (25%; 75%). Достоверность различий между группами оценивали по U-критерию Манна-Уитни с критическим уровнем 0,05. результаты и обсуждение Введение аллоксана крысам вызвало развитие гипергликемии и увеличение уровня гликозилированного гемоглобина. Концентрация глюкозы в плазме крови опытных крыс превышала её уровень у контрольных животных (4,77 [4,35; 5,08] ммоль/л) на протяжении всего периода эксперимента, максимально отличаясь от контроля на 7 день опыта - на 115% (р=0,0004). Уровень гликозилированного гемоглобина увеличивался в динамике исследования на 16% (р=0,0002), 28% (р=0,0006), 35% (р=0,0002), 39% (р=0,0003) по сравнению с контролем (4,15 [4,0; 4,3] %) на 7, 14, 21, 28 дни эксперимента соответственно. Характер изменений полученных показателей позволяет говорить о развитии диабета у экспериментальных животных, что согласуется с данными литературы [8, 12, 13]. Активность ЩФ в гомогенатах диафиза бедренной кости увеличилась на 321% к 7 дню эксперимента (р=0,01), снижаясь до 0 нмоль/л*с к 28 дню опыта (р=0,0007). (Табл. 1). Изменения в содержании кальция и фосфора в бедренной кости у аллоксан-индуцированных крыс носят однонаправ- Таблица 1 Содержание кальция и фосфора у крыс с аллоксановым диабетом, Ме [25%; 75%] Показатель Кальций, мг фосфор, мг Активность щф, нмоль/л*с Контроль (n=10) 1,9 [1,73; 1,96] 0,73 [0,71; 0,74] 208,15 [24; 316,8] Аллоксановый диабет, 7 день (n=10) 1,42 [1,37; 1,6]*** 0,62 [0,59; 0,68]** 876,55 [288; 1200]* Аллоксано-вый диабет, 14 день (n=8) 1,49 [1,22; 1,59]*** 0,64 [0,56; 0,67]** 37,8 [0; 96] Аллоксано-вый диабет, 21 день (n=8) 1,79 [1,41; 1,88] 0,66 [0,58; 0,69]** 201,95 [24; 666] Аллоксано-вый диабет, 28 день (n=10) 1,55 [1,32; 1,61]*** 0,66 [0,56; 0,7]** 0 [0; 12]*** Примечание: р - достоверность различий с контролем (*-р<0,05; р<0,01; т-р<0,001). оригинальные статьи ленный характер. Количество кальция уменьшалось на 7, 14 и 28 дни эксперимента соответственно на 25% (р=0,00002), 22% (р=0,00004) и 18% (р=0,00001) по сравнению с контролем, а содержание фосфора снижалось на 15% (р=0,002), 12% (р=0,002), 10% (р=0,006) и 10% (р=0,003) по сравнению с контролем на 7, 14, 21 и 28 дни опыта соответственно. При этом на протяжении всего эксперимента отмечалась сильная прямая корреляция между содержанием кальция и фосфора (г=0,086; р<0,01). (табл. 1). Наблюдаемые нами явления могут объясняться следующим образом. В ряду патогенетических факторов, индуцирующих развитие остеопении у больных СД, стоит образование и накопление конечных продуктов неферментативного гликозилирования белков (AGEs - advanced glycation end products) в костной ткани [14]. Действие AGEs на клеточный метаболизм может быть внутриклеточным и внеклеточным, опосредованным через рецепторы к AGEs (RAGE - receptors of AGEs) [15]. С одной стороны, гликирование костного коллагена приводит к снижению количества поперечных «сшивок» в его структуре, тем самым нарушая процесс минерализации и фиксации минеральных компонентов в матриксе костной ткани. В то же время, взаимодействие AGE-RAGE вызывает активацию ядерного фактора каппа В (NF-kB), таким образом стимулируя остеокластогенез и, следовательно, костную резорбцию [14]. Подтверждением того факта, что при осложнениях СД RAGE являются звеном в реализации патологических эффектов AGEs служит эксперимент, проведённый на мышах, лишённых RAGE, в котором показано снижение активности резорбции, увеличение костной массы и МПКТ [16]. Другой вероятной причиной изменения минерального состава костной ткани при СД 1-го типа может быть дефицит витамина Д, приводящий к потере кальция и фосфатов с мочой [17, 18]. Указанные обстоятельства могут объяснять уменьшение содержания кальция и фосфора в костной ткани при экспериментальном диабете. Роль щелочной фосфатазы (ЩФ) в процессах остеогенеза заключается в увеличении локальной концентрации фосфатов, необходимого для формирования центров кристаллизации, за счёт отщепления фосфатных остатков от фосфо-рорганических эфиров и фосфопротеинов [10]. Информация об изменении уровня данного показателя при инсулинзависимом СД носит противоречивый характер. Показано достоверное увеличение активности ЩФ у больных СД как за счёт высокого уровня печеночной и кишечной изоформ, так и в связи с высокой активностью костной изоформы данного фермента [13]. Между тем, выявлено существенное снижение активности ЩФ в бедренной кости при стрептозотоци-новом диабете у грызунов [19]. Увеличение количества остеобластов, наблюдающееся при дефиците витамина Д [20], объясняет усиление синтеза ЩФ, и, следовательно, рост её активности на 7 день опыта (табл. 1). Угнетение ферментативной деятельности ЩФ в гомогенатах костной ткани на 28 день эксперимента (табл. 1) с одной стороны может быть обусловлено дефицитом инсулиноподобного фактора роста-i, опосредованного наблюдающейся при экспериментальном диабете инсулинопенией [8, 21], с другой - угнетением функции остеобластов в связи с накоплением AGEs [14]. выводы Впервые выявлено, что аллоксановый диабет у крыс сопровождается снижением содержания фосфора в компактной костной ткани с пиком изменения на 7 день опыта. 7 оригинальные статьи № 2/2015 Остеопороз и остеопатии Аллоксановый диабет у крыс приводит к снижению количества кальция в компактной кости с максимумом изменения на 7 день эксперимента. В динамике аллоксан-индуцированного диабета впервые выявлен фазный характер изменения активности ЩФ в компактной костной ткани, характеризующийся увеличением активности фермента на 7 день опыта и угнетением - на 28 день эксперимента.