ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕМАТОГЕННОГО ОСТЕОМИЕЛИТА

Актуальность темы исследования. Хронический гематогенный остеомиелит (ХГО) является широко распространенным заболеванием, _ составляя до 6% в структуре патологии опорно-j § двигательного аппарата и 7-12% в ряду заболеваний, относящихся к хирургической инфекции [1,2,3]. Несмотря на достигнутые успехи в борьбе с хирургической инфекцией, ХГО не потерял своей актуальности. По данным отечественных и зарубежных авторов частота неудовлетворительных результатов лечения по-прежнему высока и составляет 12-25%, а рецидивы - в 20-40% случаев [4,5,6,7]. В связи с чем, больные нередко подвергаются многократным хирургическим вмешательствам и остаются неизлеченными, нередко на десятки лет. Частота инва-лидизации при ХГО достигает 90% и это притом, что чаще всего, заболевают лица мужского пола, к тому же преимущественно работоспособного возраста [8,9,10,11,12]. Основными причинами возникновения гематогенного остеомиелита позвоночника являются состояния, обусловленные снижением локального и системного иммунных ответов вследствие приобретенного иммунодефицита различной этиологии, на фоне проводимых хирургических вмешательств, хронических системных заболеваний. Острый гематогенный остеомиелит при неадекватном лечении или отсутствии как такового может перейти в хроническую форму. Последнее влечет за собой проблему не только повышения устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП), но и их стойкое пер-систирование в организме человека в течение длительного времени. Возбудителем ХГО, являются стафилококки - в 68,7% и, прежде всего, коагулаза-положительные, реже - полимикробная флора и патогенные грибы, а также St. Epidermidis, St. Saprophyticus - 24, 9% и, наконец присутствует протей - в 6,4% случаев, монокультура выявлялась в 62,7% случаев [13]. В настоящее время в лечении и профилактике ХГО широко применяются консервативные и хирургические методы лечения. Например, фотодинами-ческая терапия гнойных ран [14], комплексное использование озона и повиаргола [15], широкие лампасные разрезы абсцессов с дренированием и достаточным обеспечением дренажа гноя [16] и т.д. Однако, особенности течения воспалительного процесса в костном мозге, диктуют необходимость поиска новых способов и методов лечения и профилактики гематогенного остеомиелита. Бесспорным является то, что до настоящего времени хирургический метод лечения ХГО остается основным. Учитывая, что неблагоприятные результаты лечения - рецидивы остеомиелита и в настоящее время достигают 20-30% целесообразно продолжение поиска оптимальных способов лечения данного заболевания [17]. По анализу историй болезни отделения костно-суставного туберкулеза УНИИФ, 8 № 3/2016 Остеопороз и остеопатии ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ за 2011-2014 гг, он составил 16%. На сегодняшний день используются различные методы санации гнойных очагов при остеомиелите: механические, физические, химические, биологические, смешаные, в числе которых обработка очага озонированным физиологическим раствором (ОФР). По результатам ряда исследований [18] благодаря обработке гнойных очагов ОФР, снижается рост бактериальной флоры. Однако следует подчеркнуть, что эти исследования проводились в условиях in vitro. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Обосновать применение озонированного физ- раствора в лечении ХГО путем проведения экспериментального исследования и разработки оптимальных методик воздействия на грамм (+) и грамм (-), грибы рода Candida, микобактерии туберкулеза Материал и методы исследования. С целью уточнения электрохимических процессов в эксперименте оценена динамика физико-химических параметров (рН, окислительно-восстановительного потенциала, содержания растворенного кислорода) в 0,9 % р-ре хлорида натрия (NaCl), насыщенного источником активных форм кислорода - озонатором При этом исследованы концентрации озона - 1000, 5000 и 10000 мкг/л. Уровень рН и окислительновосстановительного потенциала (ОВП) определяли с помощью портативного рН-метра «HI-8314» (Румыния). Температурный градиент и содержание растворенного кислорода оценивали с применением оксигенометра «Oxygenmeter ATT-3010» (Тайвань). Установлено, что озонирование, не изменяя рН жидкой системы, дозозависимо стимулирует ее окислительный потенциал. Так, озонирование физраствора вне зависимости от концентрации данной активной формы кислорода не способствует смещению кислотности среды. Четкая зависимость от дозы была выявлена нами при использовании различных насыщающих концентраций озона. Так, при увеличении действующей концентрации озона с 1000 до 5000 мкг/л прирост ОВП нарастает с 61,2 ± 2,1 до 139,0 ± 3,8 мВ (в 2,3 раза; p < 0,05), а при применении концентрации озона 10000 мкг/л - до 340,0 ± 5,6 мВ (в 5,5 раза >по сравнению с концентрацией 1000 мкг/л, p < 0,05; в 2,45 раза -к концентрации 5000 мкг/л, p < 0,05). Для исследования действия озонированного физраствора на грамм (+) и грамм (-) флору проведена серия опытов по методике Кувакиной Н.А. и соавт. [18]. При оценке результатов этих опытов мы пришли к заключению, что использование данной методики in vivo не рационально, так как она не учитывает колониеобразующие единицы (КОЕ) бактерий, находящихся в стенке абсцесса, секвестрированных мягких тканях, фрагментах костной ткани. Для приближения условий эксперимента к условиям операционной раны in vivo использовали носитель бактериальной культуры - лавсановую ткань обладающую гигроскопичностью и позволяющую в значительной мере смягчать воздействие агрессивных антисептических растворов на КОЕ, имитируя стенку абсцесса (далее обозначаемую, как тест объект). Приготовление бязевых тест-объектов проводилось согласно Инструкции МЗ РФ по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств от 6 мая 1968 г № 739-68. Лоскут бязи погружают на 24 часа в холодную водопроводную воду для удаления крахмала, тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат, и отутюживают. Из приготовленной ткани с помощью иглы выдергивают нитки в про дольном и поперечном направлениях на расстоянии 10 мм друг от друга. По приготовленным линиям ткань разрезают ножницами на тест-объекты размером 1х1 см и по 50 штук раскладывают в чашки Петри. Чашки Петри с тест-объектами стерилизуют в автоклаве 30 мин. при температуре 126" С. С целью определения оптимального экспозиционного временинамибыла проведена серия опытов с культурами (музейными штаммами^. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653. РЕЗУЛЬТАТЫ Эксперимент № 1. Приготавливают бактериальную взвесь (суспензию) суточных культур S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653 на физрастворе NaCl. Концентрацию микробных тел в 1 мл бактериальной взвеси во всех случаях устанавливают посредством сравнения оптической плотности полученной бактериальной взвеси со стандартом мутности 0,5 и 1,5 (McFarland Standard Etalon, пр-во Франции, Densilametr автоматический прибор для определения оптической мутности). Концентрация бактерий в приготовленной исходной суспензии в обеих сериях опытов для всех указанных штаммов микроорганизмов была одинаковой, и составляла 150 х106 (1,5x108) микр. тел/мл (0,5 McFarland) и 450 х106 (4,5x108) микр. тел/мл (1,5 McFarland). В итоге получили12 пробирок: 2 пробирки объемом 10мл с мутностью 0,5 McFS. aureus 25923 АТСС и 2 пробирки объемом 10мл с мутностью 1,5 McFS. aureus 25923АТСС; 2 пробирки объемом 10мл с мутностью 0,5 McFPs. aeruginosa 27853 АТСС и 2 пробирки объемом 10мл с мутностью 1,5 McFPs. aeruginosa 27853АТСС; 2 пробирки объемом 10мл с мутностью 0,5 McFC. albicans 401/885653 и 2 пробирки объемом 10мл с мутностью 1,5 McFC. albicans 401/885-653. Далее, одну из пробирок разных серий с взвесью объемом 10 мл и оптической мутностью 0,5 McFS. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС и C. albicans 401/885653 озонировали в течение 5 мин. В последующем осуществляли посев на мясопептонный агар (S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС) и агар Сабуро (C. albicans 401/885-653) по 100 микролитров (мкл).Далее инкубируют при температуре 37о С в течение 18-24 час., последующие 18-24 час.,при комнатной температуре. Далее, одну из каждой серии пробирок с взвесью объемом 10мл и оптической мутностью 1,5 McFS. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС и C. albicans 401/885-653 озонировали в течение 5 мин. с последующим посевом на мя-сопептонный агар (S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС) и агар Сабуро (C. albicans401/885-653) по 100 мкл, с последующим инкубированием при 37о С в течении 18-24 час., последующие 18-24 час. при комнатной температуре. Во вторые из серии пробирок объемом 10мл с мутностью 0,5 McFS. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС и C. albicans 401/885-653 погружают бязевые тест - объекты на 10 мин. Стерильные бязевые тест-объекты перекладывают в 10 мл суспензии суточных культур S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653, содержащей 1.5х108 КОЕ/мл, и, равномерно смачивают, оставляют тест-объекты в суспензии в закрытой пробирке. Через 30 мин. бязевые тест-объекты, контаминированные бактериальной суспензией, стерильным пинцетом переносили в чашку Петри на поверхность 2-х слойной стерильной фильтровальной бумаги, покрывают их сверху стерильной бумагой, и закрывают чашку. 9 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ № 3/2016 Остеопороз и остеопатии Оставляют на 10 мин. с целью удаления избытка жидкости. Для фиксации микроорганизмов на бязевых тест-объектах последние переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 37°С в течение 20 мин. с приоткрытыми крышками. Стерильным пинцетом погружают контаминирован-ные тест-штаммом тест-объекты в пробирки с физиологическим раствором (объем физиологического раствора в пробирке рассчитывался с учетом соотношения 3,0 мл р-ра на 1 тест-объект, т.е., например, для 3-х тест-объектов использовали 9,0 мл р-ра), проводят озонирование физраствора газовоздушной смесью О3 в концентрации 10мг\ литр и фиксируют время начала опыта. По истечении времени экспозиции равной 5 мин для S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653, стерильным пинцетом извлекали тест-объекты из р-ра. При помощи пинцета размещали тест-объекты на поверхности питательной среды МПА (мясопептонного агара) для S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, и агар Сабуро для C. albicans 401/885-653. На поверхности питательной среды размещают 3 тест-объекта. Это позволяет без дополнительных затрат увеличить количество проб, а стало быть, и достоверность результатов оценки эффективности озонированного физраствора. Засеянные чашки Петри закрывают крышками, помещают в термостат и инкубируют при 37 °С в течение 18-24 час.Учет результатов посевов проводили визуально путем подсчета выросших колоний на самом тест-объекте и на поверхности питательной среды (табл. 1,2,3). Наличие роста колоний тест-бактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды показывает, что озонирование при данной экспозиции времени воздействия не обеспечивает надежного бактерицидного эффекта. Отсутствие роста колоний тест-бактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды свидетельствует о наличии бактерицидной эффективности. Во вторую серию из пробирок объемом 9мл с мутностью 1,5 McF S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС и C. albicans 401/885-653 погружают бязевые тест - объекты на 10 минут. Стерильные бязевые тест-объекты перекладывают в 10 мл суспензии суточных культур S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653, содержащей 4.5х108 КОЕ/мл, и, равномерно смачивают, оставляют тест-объекты в суспензии в закрытой пробирке. Через 30 мин. бязевые тест-объекты, контаминирован-ные бактериальной суспензией, стерильным пинцетом переносили в чашку Петри на поверхность двухслойной стерильной фильтровальной бумаги, покрывают их сверху стерильной бумагой, и закрывают чашку. Оставляли на 10 мин. с целью удаления избытка жидкости. Для фиксации микроорганизмов на бязевых тест-объектах последние переносили на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывали стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивали в термостате при 37°С в течение 20 мин. с приоткрытыми крышками. Стерильным пинцетом погружали контаминирован-ные тест-штаммом тест-объекты в пробирки с физиологическим раствором (объем физиологического раствора в пробирке рассчитывался с учетом соотношения 3,0 мл раствора на 1 тест-объект, т.е., например, для 3-х тест-объектов использовали 9,0 мл р-ра), проводили озонирование физраствора газовоздушной смесью О3 в концентрации 10мг\литр и фиксировали время начала опыта. По истечении времени экспозиции равной 5 мин. для S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653, стерильным пинцетом извлекают тест-объекты из раствора. При помощи пинцета размещают тест-объекты на поверхности питательной среды МПА для S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, и агар Сабуро для C. albicans 401/885-653. На поверхности питательной среды разместили 3 тест-объекта. Это позволило без дополнительных затрат увеличить, количество проб, соответственно и достоверность результатов оценки эффективности озонированного физраствора. Засеянные чашки Петри закрывали крышками, помещали в термостат и инкубировали при 37 °С в течение 1824 часов. Учет результатов посевов проводили визуально путем подсчета выросших колоний на самом тест-объекте и на поверхности питательной среды. Наличие роста колоний тест-бактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды показывает, что озонирование при данной экспозиции времени воздействия не обеспечивало надежного бактерицидного эффекта. Отсутствие роста колоний тест-бактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды свидетельствует о наличии бактерицидной активности. Учитывая рост бактериальных культур на всех тестируемых объектах, принято решение увеличить время экспозиции. Эксперимент № 2. В пробирки объемом 10мл с мутностью 1,5 McFS. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853 АТСС и C. albicans 401/885-653 мы погрузили бязевые тест - объекты на 10 минут. Стерильные бязевые тест-объекты перекладывали в 10 мл суспензии суточных культур S. aureus 25923 АТСС, Ps. aeruginosa 27853АТСС, C. albicans 401/885-653, содержащей 4.5х108 КОЕ/мл, и, равномерно смачивали, оставляли тест-объекты в суспензии в закрытой пробирке. Далее описание технологии эксперимента № 2 аналогично технологии эксперимента № 1. Наличие роста колоний тест-бактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды показывало, что озонирование при данной экспозиции времени воздействия не обеспечивало надежного бактерицидного эффекта. Отсутствие роста колоний тест-бактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды свидетельствовало о наличии бактерицидной эффективности. ВЫВОДЫ. 1.Экспериментально (in vitro) нами доказана высокая эффективность озонированного физраствора в отношении S. aureus 25923 АТСС при экспозиции 20 мин.^. aeruginosa 27853 АТСС при экспозиции 30 мин. На штамм C. albicans 401/885-653 обработка озонированным физраствором оказывает бактериостатическое и выраженное ингибирующее воздействие при экспозиции 30 мин. 2. Дополнение интраоперационной химической санации ран обработкой озонированным физраствором позволяет добиться значительного снижения микробной обсе-мененности костной полости и мягких тканей ниже критического уровня микрофлоры в тканях. 3. Модификация эксперимента - погружения лавсановой полоски с адсорбированными КОЭ в озонированный физраствор и постоянным его обновлением максимально полно имитирует интраоперационную ситуацию при обработке стенки абсцесса, позволяя подобрать оптимальные режимы обработки ОФР. При переносе эксперимен 10 № 3/2016 Остеопороз и остеопатии ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ та в in vivo, как мы полагаем, повысится эффективность местного и системного применения озонированного физраствора в комплексном лечении больных ХГО.