Полиморфизм некоторых генов метаболизма костной ткани (VDR Bsm1 c.IVS7G>A, LCT 13910 T>C, COL1A 12046 G->T) у представительниц русской и бурятской национальностей

Обоснование

Остеопороз – это мультифакториальное заболевание скелета, характеризующееся снижением минеральной плотности костной ткани и повышением риска переломов. По данным Всемирной Организации Здравоохранения остеопороз вышел по значимости на четвёртое место среди неинфекционных заболеваний после сердечно-сосудистой, онкологической патологии, диабета и представляет большую социальную и медицинскую проблему для общества [1].

Хорошо известно, что своевременная профилактика и ранняя диагностика различных заболеваний являются актуальными вопросами современной медицины. В клинической практике риск развития мультифакториальных заболеваний определяют посредством молекулярного тестирования генов, получивших название кандидат-генов [1].

 Близнецовые и семейные исследования показали, что минеральная плотность костной ткани (МПК) и обновление костей находятся под  генетическим контролем. Гены-кандидаты можно разделить на пять основных категорий: гены ответственные за гомеостаз кальция; гены, мутации в которых приводят к гормональной дисфункции; гены ответственные за метаболизм и регуляцию остеобластов и остеокластов; гены, белковые продукты которых входят в матрикс костной ткани и гены ответственные за липопротеиновый обмен [1].

Буряты – коренное население Бурятии, Усть-Ордынского Бурятского автономного округа Иркутской области, Забайкальского края. Подверженность к многофакторным заболеваниям (сердечно-сосудистая патология, гестоз, хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабет I типа) у бурят и русских определяется спектром различных генетических маркеров [2]. Так, в работе Т.П. Бардымовой установлено, что заболеваемость СД I типа среди бурятского населения ниже в 18 раз (2,14 на 100 тыс. человек), а распространенность ниже в 9 раз соответствующих российских показателей. Только 0,02 % лиц бурятской национальности страдает СД 1 типа (в промышленно развитых странах – от 4 до 6 %). Поздние сосудистые осложнения (диабетическая ретинопатия (22,7 %) и диабетическая нефропатия (10,6 %)) у больных СД I типа бурятской популяции встречаются реже, чем в общей популяции [3]. Однако исследования полиморфизма генов, принимающих участие в метаболизме костной ткани, до настоящего времени не проводились.

Цель

Изучить частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ремоделирования костной ткани (гена рецептора витамина D Bsm1 c.IVS7G >A, гена лактазы LCT 13910 T>C и гена коллагена COL1A 12046 G->T) у здоровых и больных ОП женщин русской и бурятской национальностей.

Методы

В одномоментное исследование вошло 97 женщин с ОП: 49 русской и 48 бурятской национальностей в возрасте от 50 до 80 лет. В качестве контрольной группы для оценки распределения генотипов в популяциях было обследовано 123 здоровых женщины, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования была выбрана точка мутации гена рецептора витамина D (vdr) Bsm1 c.IVS7G >A, гена лактазы (LCT) -13910 T>C и гена коллагена COL1A 12046 G->T. В работе использовались стандартные наборы праймеров НПФ «Литех» - «SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия, проходящем в ультрафиолетовом цвете.  Диагноз ОП устанавливался согласно «Российским клиническим рекомендациям по остеопорозу» 2012 года, включая данные денситометрии и наличие остеопоротических переломов в анамнезе. Статистическая обработка данных проводилась с использованием on-line калькулятора (http://gen-exp.ru/calculator.php) а также программы для расчета относительного риска KRelRisk v 1.1 для Linux (http://forum.disser.ru/index.php?showtopic=571). Для сравнения частот генотипов и аллелей в двух группах использовали критерий х^2. Различия между группами при значении уровня р<0,05 рассматривались как статистически значимые.

Результаты

У 220 женщин было проведено молекулярно-генетическое исследование с определением следующих генных полиморфизмов: VDR - Bsm1 c.IVS7 G>A, LCT -13910 T>C, COL1A  - 12046 G->T. Распределение аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов у пациенток с ОП и здоровых женщин обеих национальностей представлено в таблицах 1-3.

При исследовании аллелей и генотипов по полиморфизму VDR - Bsm1 c.IVS7G>A (таблица 1) мы выявили, что генотип G/G достоверно чаще встречался среди здоровых женщин бурятской национальности (р=0,01). Генотипы G/A и А/А, содержащие в своём составе минорный аллель А, преобладали в группе русских женщин с ОП (р=0,003). При анализе частоты встречаемости аллелей так же было выявлено преобладание доминантного аллеля G в группе здоровых женщин бурятской национальности (р=0,001). Было установлено, что в группе в бурят с ОП происходило накопление минорного аллеля А, который у индивидуумов повышает риск развития ОП, однако статистической значимости выявлено не было (ОР=1,04, ДИ [0,68; 1,6]).

Таблица 1. Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов vdr Bsm1 c.IVS7 G >A среди больных ОП и здоровых женщин

Примечания: * - статистическая значимость с группой клинического сравнения.

При анализе связей распределения аллелей и генотипов полиморфизма LCT -13910 T>C (таблица 2)  нами было установлено,  что генотипы С/С и С/Т среди женщин с ОП одинаково часто встречалась среди представительниц  обеих национальностей (р=0,04). Однако, следует отметить наличие в группе русских женщин рискового мутантного генотипа Т/Т, способствующего сохранению лактазной активности (р=0,0005). Было выявлено, что аллель С ассоциирован с развитием ОП в большей степени среди представительниц бурятской национальности, однако статистической значимости получено не было  (ОР=1,04, ДИ [0,65; 1,6]).

Таблица 2. Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов LCT -13910 T>C среди больных ОП и здоровых женщин

Примечания: * - статистическая значимость с группой клинического сравнения.

При анализе частоты встречаемости G и Т аллелей гена COL1A 12046 G->T (таблица 3)  нами было выявлено, что среди женщин в обеих группах в большинстве случаев встречался гомозиготный доминантный аллель G, причем у представительниц бурятской национальности он встречался достоверно чаще - около 97% (р=0,0003), а минорный аллель Т преобладал среди русских женщин (0,173) (р=0,0003). Так же было выявлено, что генотипы G/Т и Т/Т полиморфизма гена COL1A 12046 G->T связаны с развитием ОП среди женщин обеих национальностей (ОР 1,2 ДИ [0,8; 1,7]).

Таблица 3. Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов COL1A 12046 G->T среди больных ОП и здоровых женщин

Примечания: * - статистическая значимость с группой клинического сравнения.

Обсуждение

Эндокринная система витамина D играет важную роль в регуляции гомеостаза кальция и фосфата. Эта деятельность опосредована рецептором витамина D, который особым образом связывается с 25-дигидрокси-витамином D3 для регуляции развития архитектоники костной ткани, гормональной секреции инсулина а так же, иммунной функции. Ген рецептора витамина D (VDR) локализуется на 12-й хромосоме, имеет 11 экзонов и приблизительно  75 килобайт генома ДНК. В настоящее время исследовано влияние на МПК и риск развития переломов ряда полиморфизмов VDR, таких как FokI (Allele F/f, SNP C>T, rs2228570), Bsm I (Allele B/b, SNP G>A, rs1544410), Apa I (Allele A/a, SNP C>A, rs 17879735) (Allele T/t, SNP T>C, rs 731236). Некоторые из этих исследований выявили значительную связь полиморфизма гена VDR с развитием остеопороза, в то время как другие, достоверной взаимосвязи не обнаружили. Данные несоответствия могут быть преходящими вследствие генетической гетерогенности, смешения национальностей, влияния внешней среды и генетического взаимодействия [4]. 

1. Garnero et al. (2005) изучали связь полиморфизмов гена VDR с возникновением переломов, вертебральной (позвоночные) и невертебральной локализации [5]. Была выявлена ассоциация между увеличением частоты рецессивного аллеля В (A) единичного нуклеотидного полиморфизма в сайте рестрикции BsmI в восьмом интроне гена у женщин с впервые зарегистрированными переломами. Относительный риск подобных переломов для женщин с генотипом Bb (GA) составил 1.5 (95% DI, 0.95-2.40), а в случае наличия генотипа BB (AA) 2.10 (95% доверительный интервал, 1.16-3.79) по сравнению с женщинами несущими генотип bb (GG). [5].

С.В. Юренева и соавторы выявили взаимосвязь генотипа G/G  полиморфизма  rs1544410  гена VDR  с увеличением риска переломов дистального отдела лучевой кости [6]. В нашем исследовании расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию аллеля  А гена VDR  полиморфизма Bsm1 c.IVS7G >A с развитием ОП среди представительниц бурятской национальности (ОР=1,04, ДИ [0,68; 1,6]). Среди русских женщин подобной взаимосвязи выявлено не было (ОР=0,2, ДИ [0,7; 1,7]).

Ген COL1A1 кодирует аминокислотную последовательность альфа-1 цепь белка коллагена 1 типа. Коллаген представляет собой белковую основу соединительных тканей, в том числе костной. Благодаря коллагену костная ткань сочетает твердость и прочность с гибкостью и эластичностью.  Полиморфизм гена COL1A1 представляет собой точечную замену нуклеотида гуанина на тимин, что приводит к нарушению сайта связывания для фактора транскрипции гена COL1A1 в области первого интрона. У носителей варианта Т данного полиморфизма наблюдается нарушение нормального соотношения субъединиц в молекуле коллагена, что приводит к ухудшению его механических свойств, несовершенному остеогенезу, развитию синдрома Элерса-Данло и идиопатическому (спонтанному) остеопорозу. Вследствие этого носители варианта Т, особенно женщины в постменопаузе, гомозиготные по данному варианту, подвержены остеопорозу, костным переломам. [7]. Идентификация полиморфизма регуляторной области гена COLIA1 оказалась наиболее продуктивной.  Так S.F.A. Grant и соавторы установили, что G/Т гетерозиготы имели более низкую минеральную плотность костной ткани нежели G/G гомозиготы (СС) в двух популяциях британских женщин. У женщин, имеющих тяжелый остеопороз и компрессионные переломы позвонков в анамнезе, в 54% определялись генотипы с рецессивным аллелем Т (G/Т и Т/Т), по сравнению с группой контроля – 27%.  [8].

В нашем исследовании также была выявлена взаимосвязь между присутствием генотипов G/Т и Т/Т полиморфизма гена COL1A 12046 G->T и развитием ОП среди женщин как русской, так и бурятской национальностей.

Ген LPH (LCT) кодирует аминокислотную последовательность фермента лактазы. Этот фермент вырабатывается в тонком кишечнике и участвует в расщеплении молочного сахара - лактозы. Лактаза обычно присутствует у детей, во взрослом состоянии (обычно в возрасте 3-10 лет) фермент перестаёт вырабатываться. Употребление молочных продуктов в этом случае приводит к кишечным расстройствам вследствие неусвоения лактозы.

Полиморфизм C.-13910C>T гена лактазы (LPH) влияет на выработку лактазы у взрослых. Эта область генома представляет собой элемент внутренней регуляции транскрипционной активности промотора гена лактазы. При этом нормальный вариант полиморфизма С связан со снижением синтеза лактазы во взрослом состоянии, а мутантный вариант Т - с сохранением у взрослых высокой лактазной активности. Таким образом, гомозиготные носители варианта С не способны к усвоению лактозы, в то время как гомозиготные носители варианта T легко усваивают лактозу и хорошо переносят молочные продукты. Женщины в постменопаузе, располагающие вариантом С, имеют больший риск развития остеопороза и требуют назначения препаратов кальция. [9]. Мутантный аллель Т нами был обнаружен только среди представительниц русской национальности, что обуславливает сохранение лактазной активности в данной группе.  Так же была подтверждена гипотеза об ассоциации аллеля C с развитием заболевания, однако только в группе женщин бурятской национальности.

выводы

1. Женщины бурятской национальности при наличии аллеля А гена VDR полиморфизма Bsm1 c.IVS7G >A, аллеля С гена лактазы LCT -13910 T>C имеют более высокий риск развития остеопороза, чем русские женщины.
2. Наличие генотипов G/Т и Т/Т полиморфизма гена COL1A 12046 G->T связано с развитием остеопороза среди представительниц обеих национальностей.

Дополнительная информация.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.